精確分析生物樣本中的小分子代謝物——IC-MS在代謝組學中的應用
高分辨質(zhì)譜（HRMS）技術(shù)結(jié)合生物信息學和統(tǒng)計分析是當前表征生物樣本中小分子代謝物的主要手段之***。然而，由于生物體內(nèi)代謝物的結(jié)構(gòu)復雜、多樣，實現(xiàn)生物樣本中小分子代謝物的全覆蓋鑒定和準確定量分析仍然是本領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)。其中，大極性、離子代謝物的檢測尤其受到關(guān)注。離子色譜主要使用離子交換的分離原理，和常規(guī)液相色譜主要基于疏水吸附的反相分離原理形成互補，可以很好分離常規(guī)液相色譜難以分離的強極性可電離代謝物。即使是基于親水相互作用的HILIC色譜可以分離強極性代謝物，但也難以分離強電離代謝物。離子型物質(zhì)分離，必須使用離子型物質(zhì)做為流動相，但離子型物質(zhì)本身與質(zhì)譜的***佳檢測環(huán)境并不兼容。因此，我們需要安裝膜抑制器作為***個持續(xù)工作的脫鹽裝置，通過膜轉(zhuǎn)移的原理去除對位離子，使酸堿變成純水，從而實現(xiàn)與質(zhì)譜兼容。
圖1 不同極性化合物需要不同的色譜分離系統(tǒng)進行分析 （點擊查看大圖）
分離度 核苷酸、糖類等在代謝通路中存在多個同分異構(gòu)體，這些同分異構(gòu)體在細胞代謝中承擔著不同且重要的功能。因此，我們不僅需要檢出相關(guān)化合物，更需要將這些同分異構(gòu)體代謝物進行有效色譜分離。圖2展示了IC與HILIC分析21種極性代謝物對照品的分離效果。大部分化合物在HILIC色譜柱上出峰情況良好，然而，對于磷酸糖類以及順式、反式丁烯二酸等同分異構(gòu)體代謝物來說，HILIC的分離效果明顯差于IC。在細胞樣本的測試中，不同色譜條件下對m/z 259.0224進行提取離子流（圖3）。IC色譜條件下檢測到了11個色譜峰，檢出數(shù)量和強度顯著高于其他色譜條件。根據(jù)精確質(zhì)荷比信息，推測該系列化合物的元素組成為C6H13O9P，在代謝物數(shù)據(jù)庫中檢索，有至少33個代謝物符合該元素組成，其中包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖等多種重要的磷酸單糖。 圖2 21種代謝物對照品使用IC和HILIC進行分離的峰形比較（點擊查看大圖） 圖 3 細胞樣本中磷酸單糖化合物在不同色譜條件下的色譜分離比較（點擊查看大圖） 向下滑動查看所有內(nèi)容
靈敏度 在濃度為60 ppb（0.2-0.7 μmol/L）的情況下，使用IC-MS分析極性代謝物對照品。（圖2）這些代謝物的信噪比（S/N）約為1000，相當于柱上量0.5-2.5 pmol。其中***半的代謝物可在非常低的濃度下（60 ppt，相當于柱上樣量3.4 fmol以下）被檢測到，信噪比在3到20之間。***低檢測限（LODs）的濃度范圍為0.04-0.5 nmol/L（見表1），展示了超高靈敏度。 表1 21種代謝物在cap IC-Orbitrap平臺的***低檢測限（LODs） （點擊查看大圖）
重現(xiàn)性 在連續(xù)6天的日間穩(wěn)定性考察中，每天平行測試6針對照品混標（600 ppb），所有化合物的保留時間和響應強度RSD均小于8%，完全適應代謝組學分析要求。（圖4）在實際細胞樣本測試中，6種細胞中的11種磷酸單糖以及穩(wěn)定同位素內(nèi)標馬尿酸-d5的色譜保留時間和響應強度同樣表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性（n=3）。 圖4 日間重現(xiàn)性考察（n=6） （點擊查看大圖） 圖5 不同細胞樣本中11種磷酸單糖的離子流圖 （點擊查看大圖） 向下滑動查看所有內(nèi)容
代謝通路覆蓋度 采用IC-MS的方法進行細胞代謝組學分析，幾乎完整地覆蓋了糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要代謝物。（圖6）通過相關(guān)測試結(jié)果，可以幫助我們有效觀察細胞能量代謝、代謝穩(wěn)態(tài)的變化。 圖6 糖酵解、TCA代謝途徑及細胞樣本中相關(guān)代謝物含量測試結(jié)果（點擊查看大圖） 向下滑動查看所有內(nèi)容
小結(jié) 離子抑制技術(shù)的發(fā)展，特別是連續(xù)電解離子抑制技術(shù)，使得離子交換色譜與高分辨質(zhì)譜的結(jié)合成為可能，這種組合帶來了新的分析機會。IC-MS平臺技術(shù)的商業(yè)化推廣使得越來越多的實驗室探索了IC-MS的新應用領(lǐng)域，并揭示了超出傳統(tǒng)應用領(lǐng)域的成功案例。例如，除了對無機離子的分析外，有機和生物極性和離子分析物已經(jīng)成功地在廣泛的環(huán)境和生物樣品類型中進行了有針對性的分析和表征。使用離子抑制的IC-MS分析具有產(chǎn)生洗脫劑和極性選擇性的組合特性，減少了有效基質(zhì)復雜性，降低了質(zhì)譜檢測中可能導致分析干擾的基質(zhì)效應和色譜擁擠。分析物通常已經(jīng)處于離子形式；因此，通過質(zhì)譜檢測實現(xiàn)高靈敏度分析可以***大程度地減少離子抑制。相比之下，用于離子和高極性分析物表征的其他色譜方法（如RP-MS、HILIC-MS、GC-MS和IP-MS）可能抑制分析物的離子特性（使用低質(zhì)子溶劑、衍生化等），以便提供有效的分析條件，這可能導致覆蓋范圍和信號抑制的偏差。總之，IC-MS已經(jīng)成為***種有效的互補（或替代）分析工具，表現(xiàn)出高水平的平臺穩(wěn)定性、保留時間重現(xiàn)性、靈敏度和低檢測限。迄今為止，大多數(shù)應用集中在法醫(yī)科學、環(huán)境科學、技術(shù)和制造業(yè)以及食品化學領(lǐng)域。然而，在制藥科學、臨床化學、診斷學、微生物學、代謝組學和細胞生物學等領(lǐng)域的應用越來越多，這些領(lǐng)域還有許多重要的進***步發(fā)展和應用的空間（圖5）。無論是在復雜基質(zhì)中還是在高極性或離子分析物中，IC-MS都有新的應用空間。展望未來，我們認為IC-MS的未來應用將包括對復雜生物和環(huán)境系統(tǒng)和過程的深入研究，宿主-病原體關(guān)系，微生物組代謝，植物與土壤化學之間的關(guān)系，藥代動力學和藥效動力學，以及與疾病的診斷、預后和病因相關(guān)的生物標志物研究。從傳統(tǒng)意義上講，這些領(lǐng)域在分析上具有特殊的挑戰(zhàn)性，特別是在使用非靶向方法時；因此，IC-MS在發(fā)現(xiàn)導向和有針對性應用中有潛力發(fā)揮重要作用。
(文章來源于儀器網(wǎng))
