膠原蛋白重組大公開，讓CHO cell承“胞”你的美！
古今中外，愛美之心人皆有之，人們通過食補、醫美等方式來維持肌膚吹彈可破，光澤飽滿的狀態。在醫美中，注射類產品包括膠原蛋白類、玻尿酸類、以聚乳酸代表的再生制劑類、肉毒素類，以及新興起的外泌體類等類別。其中，膠原蛋白作為人體各種組織內的細胞外基質 (ECM) 主要成分，以其優良的生物相容性備受消費者青睞。
膠原蛋白由三條多肽α鏈組成的獨特三螺旋結構，每條α鏈約有1014個氨基酸，分子量約為300 KDa。***般α鏈是重復的氨基酸序列甘氨酸-X-Y結構，X和Y多數為脯氨酸 (Pro) 和羥脯氨酸 (Hyp) [1]。目前已發現人體中含有28種不同的膠原蛋白，各具有不同的高***結構。膠原蛋白類型按照發現的時間順序以羅馬數字命名 (I–XXVIII) 命名，而在我們的皮膚中，I型、III型、Ⅴ型、Ⅵ型膠原蛋白占據較大比例。
圖1：天然膠原蛋白結構
什么是更佳的膠原蛋白提取方式？
傳統膠原蛋白從動物結締組織中提取獲得，提取方法主要包括高壓輔助的物理方法、溶劑抽提的化學方法、酶的生物化學法。但以上方法提取出來的膠原蛋白存在動物源疾病等風險。而重組膠原蛋白具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。此外，重組膠原蛋白變形溫度在72℃以上，遠高于動物源膠原蛋白的40℃，更易運輸和儲存，在醫美行業中使用更為廣泛。重組表達系統包括如大腸桿菌、酵母、動物細胞、轉基因動物和轉基因植物等。但以大腸桿菌和酵母為體系生產出來的膠原蛋白容易出現氨基酸序列簡單重復，無羥基化修飾等問題，在常溫條件下其三螺旋結構松散，甚至呈現出單鏈線性結構。 CHO細胞作為***具代表性的動物細胞表達系統，具有準確的重組蛋白翻譯后修飾，表達出的蛋白在理化特性和生物學功能***接近天然蛋白。在生產重組蛋白藥物生產中有著悠久的歷史。CHO細胞表達的重組膠原蛋白能完美還原天然膠原蛋白的三螺旋結構，即使在常溫條件下其三螺旋結構仍能緊密維持。
案例分享
1997年，Fukuda等人[2]***次發表CHO細胞表達IV型膠原蛋白 [α1(IV)] 2α2 (IV) 。研究人員使用CHO DHFR缺陷型細胞作為宿主細胞，***先將質粒轉染至細胞后進行加壓 (MTX) 篩選，終克隆A222可高表達α1 (IV) ，隨即將表達α2 (IV) 的逆轉錄病毒載體感染克隆A222細胞以獲得CHO A222-A2細胞，即可同時表達 [α1(IV)] 和α2 (IV) 。
圖2：α1 (IV) 2和α2 (IV) 的合成和分泌。Lane A-C：培養上清，Lane D-I：細胞裂解物。G和H：還原條件，A-F，I：非還原條件。Lane A，D：MT-7 CHO細胞，lane B，E和G：CHO A222細胞，lane C，F和G：CHO A222-A2細胞，lane I：細菌膠原酶消化CHO A222-A2細胞的細胞裂解物。
從SDS-PAGE結果可以看出，CHO A222細胞可表達185 KDa大小的單鏈α1 (IV) （圖2.F）。同樣，在CHO A222細胞的培養基上清中可檢測到有185 KDa的大小的α1 (IV) （圖2.G）。Control CHO MT7細胞未合成α1 (IV) 或α2 (IV)（圖2.A&D）。另外，表達的α1 (IV) 應該是單鏈結構，因為在圖2.B&E中未見更大分子量的蛋白存在。這些結果表明CHO A222細胞產生的單鏈α1 (IV) 會外泌出細胞。CHO MT7細胞在感染后會表達出170 KDa的單鏈α2 (IV) ，但不會形成三聚體 (data not shown) 。CHO A222-A2細胞可同時表達α1 (IV) 和α2 (IV)（圖2.C、F、H），此外，在lane C和F的非還原條件中出現***條大于300 KDa的條帶，但在還原條件下（圖2.H）此條帶消失且170 KDa條帶增強。此條帶只在CHO A222-A2細胞中產生，且在經過膠原蛋白酶處理后與α1 (IV) 和α2 (IV) 條帶均消失，因此可以確定CHO A222-A2細胞表達出IV型膠原蛋白，且后續實驗也有進***步驗證 (data not shown) 。 膠原蛋白的羥基化修飾對維持膠原蛋白的穩定性有重要作用，在斯坦福大學Marinkovich教授等人著作專利中[3]，研究人員將編碼脯氨酰4-羥化酶 (prolyl 4-hydroxylases, P4Hs) 的質粒經電轉轉進CHO細胞中，并挑選出穩轉CHO細胞株。
圖3：編碼脯氨酰4-羥化酶的質粒結構
CHO細胞在無選擇壓力情況下，培養至20代時，VII型膠原蛋白仍能穩定表達，這將有利于重組膠原蛋白的GMP生產（圖4）。
圖4：CHO細胞穩定表達VII型膠原蛋白
CHO細胞在生產重組膠原蛋白時，可通過優化培養基的組分和補充***些因子以提高細胞產量。在江蘇創健醫療的公開專利中[4]，
***先結合控制甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸含量促進膠原蛋白合成； 進而引入維生素C和Fe2+的結合，維持Fe2+不被氧化成有毒性的Fe3+； 同時結合優化維生素、微量元素和補充因子。
此外引入了重組小分子膠原蛋白，進***步促進膠原蛋白的高效表達，其中重組小分子膠原蛋白75?200 mg/L。
總 結 目前***內多***公司布局CHO細胞重組膠原蛋白平臺，致力于生產出更優質的膠原蛋白產品。HyClone作為旗下培養基子品牌，在CHO培養基領域深耕多年，旗下有***產品ActiPro+7ab組合以及其他培養基。
(文章來源于儀器網)
