牛結(jié)核γ-干擾素

全血培養(yǎng)試驗(yàn)操作規(guī)程

SOP序號(hào)：REAL-010

編制人員：曹瑞

青島瑞爾生物技術(shù)有限公司

2014-01-01

牛結(jié)核γ-干擾素全血培養(yǎng)試驗(yàn)操作規(guī)程

1. 簡(jiǎn)介

1.1 適用范圍

本試驗(yàn)為牛結(jié)核γ-干擾素ELISA檢測(cè)試驗(yàn)的前期試驗(yàn)，用牛型和禽型結(jié)核菌素（PPD）刺激牛全血，獲得培養(yǎng)上清。

應(yīng)用于《牛結(jié)核γ-干擾素ELISA檢測(cè)試劑盒》，目的是檢測(cè)上清中的γ-干擾素，從而判斷牛結(jié)核的感染情況。

1.2 試驗(yàn)背景

牛γ-干擾素試驗(yàn)是以刺激培養(yǎng)全血為基礎(chǔ)，檢測(cè)牛結(jié)核病的***種試驗(yàn)方法。通常，感染分支桿菌的牛，其血液中的淋巴細(xì)胞能識(shí)別特異的分支桿菌抗原（包括結(jié)核菌素PPD），淋巴細(xì)胞識(shí)別分支桿菌抗原的過(guò)程涉及細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，γ-干擾素就是其中zui重要的***種。用結(jié)核菌素(PPD)刺激培養(yǎng)牛全血，全血中的T淋巴細(xì)胞就會(huì)識(shí)別PPD，發(fā)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中***個(gè)直接的表現(xiàn)就是產(chǎn)生并釋放γ-干擾素。γ-干擾素可用γ-干擾素特異的單克隆抗體夾心法檢測(cè)。

2. 安全性

2.1 所有操作步驟都應(yīng)符合當(dāng)?shù)氐摹拔ｋU(xiǎn)物質(zhì)控制規(guī)范”

2.2 此試驗(yàn)存在***定風(fēng)險(xiǎn)，盡管風(fēng)險(xiǎn)比較小。陽(yáng)性反應(yīng)的全血可能會(huì)含有分枝桿菌，因此所有操作步驟都應(yīng)遵循下面的操作規(guī)程。

3. 材料

3.1 試劑

牛PPD、禽PPD，PBS，用前混勻。

3.2 試驗(yàn)耗材

5ml肝素采血管（無(wú)菌）、24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板（無(wú)菌）、1ml與200μl吸頭（無(wú)菌）、1.5ml Ep管、生物安全口罩、高壓滅菌袋、乳膠手套、消毒劑、記號(hào)筆。

3.3 儀器設(shè)備

單道移液器（0-1000μl，0-200μl）、8-12多道移液器、CO2培養(yǎng)箱（37°C，5%CO2）。

4. 操作程序

4.1 注意事項(xiàng)

4.1.1 處理抗原和全血需在二***生物安全實(shí)驗(yàn)室。無(wú)菌操作，保證刺激抗原和相關(guān)試劑無(wú)菌，無(wú)污染。二***生物安全實(shí)驗(yàn)室可保護(hù)實(shí)驗(yàn)者處理全血時(shí)的安全。

4.1.2 樣品接收

并非所有的全血樣品都可以用于試驗(yàn)，當(dāng)樣品出現(xiàn)下列情況時(shí)，樣品視為不合格，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行無(wú)害化處理。

（1）使用不當(dāng)真空管采血，如EDTA真空采血管。只有肝素抗凝采血管適用。

（2）冷凍或長(zhǎng)時(shí)間冷藏的全血樣品。全血樣品應(yīng)當(dāng)保存在合適的溫度（16-37°C）。

（3）無(wú)標(biāo)記的樣品。

（4）采血管破損的樣品。

（5）儲(chǔ)存時(shí)間超過(guò)8小時(shí)的樣品。

（6）出現(xiàn)凝血的樣品（少量凝血可以）。

（7）血量少于5ml的樣品。

4.2 全血采集及培養(yǎng)

4.2.1采血

無(wú)菌采集至少5ml血液放入肝素抗凝管中，輕輕顛倒幾次混合血液，使肝素溶解。室溫（22±5℃，避免溫度過(guò)高或過(guò)低）下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室并在采血后24個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。避免血液冷凍和冷藏。

4.2.2血液分裝

分裝前輕輕顛倒試管，充分混勻血液樣品。由于本試驗(yàn)需要活的淋巴細(xì)胞，因此需要將細(xì)胞損傷降至zui低。將抗凝血加入24孔組織培養(yǎng)板，每頭動(dòng)物加三管1.5mL分裝的抗凝血（見表1）。無(wú)菌條件下進(jìn)行操作。

表1 吸取血液或抗原至24孔培養(yǎng)板的推薦操作

PBS=陰性對(duì)照抗原（PBS）；AvPPD＝禽型結(jié)核菌素；BoPPD＝牛型結(jié)核菌素

4.2.3加入刺激抗原

無(wú)菌加入100μL PBS(陰性抗原對(duì)照)，禽PPD或牛PPD至相應(yīng)的孔。抗原

必須與分裝的血液充分混勻，zui好用***個(gè)微量振蕩器高速振蕩1min。如果無(wú)合

適的儀器，將細(xì)胞培養(yǎng)板及其蓋緊緊固定在***起，在光滑的表面上順時(shí)針和逆

時(shí)針各旋轉(zhuǎn)10次。小心操作不要引起交叉污染，也不要讓血液附在蓋上。避免

血液起泡。只有刺激抗原與血液完全混合，試驗(yàn)才能達(dá)到zui佳效果。

4.2.4孵育

將含有血液和抗原的組織培養(yǎng)板在37℃濕溫培養(yǎng)箱中孵育16-24小時(shí)。

4.2.5血漿樣品的收獲

用可調(diào)移液器小心吸取約400μL的上層血漿，轉(zhuǎn)入獨(dú)立的1.5mL離心管中。

吸取血漿時(shí)應(yīng)盡量避免吸入細(xì)胞。污染J少量紅細(xì)胞不會(huì)影響γ-干擾素酶免疫試驗(yàn)。

4.2.6血漿的貯存

血漿可在2-8℃貯存7天，在-20℃可貯存幾個(gè)月。貯存前，每個(gè)貯存管必須用合適的蓋子密封。在樣品架上標(biāo)記日期、操作者的***字母、管內(nèi)容物、動(dòng)物編號(hào)和牛群細(xì)節(jié)等相關(guān)信息。檢測(cè)前，樣品必須恢復(fù)至室溫并充分混勻。

5. 結(jié)果

血漿上清用《牛結(jié)核γ-干擾素ELISA檢測(cè)試劑盒》（青島瑞爾）進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

6. 參考文獻(xiàn)

[1] Wood PR, Rothel JS, McWaters PGD, Jones SL. Production and characterisation of monoclonal antibodies specific for bovine gamma interferon. Vet Immunol Immunopath, 25:37-46(1990).

[2] Wood PR, Corner LA, Plackett P. Development of a simple, rapid in vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of IFN-γ:Res Vet Sci,49:46:49(1990).

[3] Wood PR, Corner LA, Rothel JS, Baldock C, Jones SL, Coisins DB, McCormick BS, Francis BR, Creeper J, Tweddle NE. Field comparison of the interferon-gamma assay and the intradermal tuberculin test for the diagnosis of bovine tuberculosis. Aust Vet J, 68:286-290(1991).

注：文章來(lái)源于互聯(lián)網(wǎng)